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          學術論文學術Tips指南共識案例分享

          【共識解讀】《兒童肺炎支原體呼吸道感染實驗室診斷中國專家共識》解讀

          2019-08-26 16:36:00 分類:指南共識

          導語

          近日,中華醫學會兒科學分會臨床檢驗學組組織編寫的《兒童肺炎支原體呼吸道感染實驗室診斷中國專家共識》(以下簡稱“共識”)已經正式發布,其中闡述了肺炎支原體(MP)病原學特征及流行狀況、MP檢測的不同方法及特點、實驗室檢驗質量控制、實驗室診斷流程等。


          該《共識》相較于之前發表的MP臨床診治共識,有幾大亮點:

          - 闡述了MP各類方法學在檢驗前、中、后質量控制的要點

          - 采用分級推薦方式,對MP的方法學進行推薦

          - 對檢驗后病原學和血清學結果的判讀提出了分析建議

          - 將不同檢測方法的臨床應用總結成實驗室診斷流程圖

          MP概述

          肺炎支原體(Mp)是一 種常見的病原微生物,主要引起人類呼吸道感染, 尤其以兒童和青年為主。Mp是兒童社區獲得性肺炎(CAP)的重要病原體,可占 CAP 的 10%~30%,Mp流行時可增加 3~5倍。自2000 年起,大環內酯類耐藥Mp在全球各地流行的證據越來越多,對臨床抗菌治療造成一定的影響。中國、日本等國家報道的部分地區Mp耐藥率已達到90%~100%。重癥Mp肺炎治療挑戰性大,需要早診斷、早治療,實驗室病原學診斷是Mp感染診斷的關鍵。


          Mp 的檢測方法主要分病原學檢測和血清學檢測兩大類:

          一、病原學檢測

          方法學

          特點

          培養法

          靈敏度差,特異性好,3~7d培養,時間長,快速培養不符合MP生長時間,應采用分子生物學方法進行病原學診斷確證。

          肺炎支原體的直接檢測

          此類方法方便快捷,但易受人為因素干擾,如未取到感染細胞、沒有選中合適的視野或其他病原及自身的交叉抗體干擾等,均會影響結果。

          DNA檢測

          靈敏度和特異性都能滿足臨床需求。但是Mp死亡后其DNA仍可存在于部分患者體內,時間達7 周~7個月,且不易降解,導致DNA檢驗結果不能很好地用于治療效果的評估。

          RNA檢測

          RNA 檢測技術是基于核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合的一種核酸檢測方法,簡稱實時熒光恒溫擴增技術 (SAT)。其采用的靶標為16S rRNA,在Mp中以多拷貝形式存在(多達104拷貝量),其靈敏度和準確性與DNA檢測方法相比都有很大提高。由于RNA隨病原體死亡而降解,可作為評價Mp感染轉歸、藥物療效的指標,其檢測結果與Mp的感染嚴重程度相關性較好,因此Mp的RNA檢測是目前早期快速診斷、判斷療效的可靠方法之一。


          二、血清學檢測

          與病原學檢測方法比較,抗體產生有時間窗和個體差異,但抗體檢測結果不受抗生素治療的影響。


          血清學方法

          優缺點

          ELISA

          具有較高的敏感度和特異度,其包被的Mp抗原來源多樣,建議選擇敏感度和特異度均較高的抗原包被試劑盒檢測。

          PA

          檢測Mp總抗體,方法重復性好,特異度、敏感度佳,治療前后雙份血清滴度的變化更有利于診斷。

          GICT

          目前是定性試驗,患者抗體含量較低時可能造成漏檢,且抗體在部分治愈患者體內持續存在,使得對短期內再次感染的陽性判斷造成困擾。

          CLIA

          目前此方法的應用、與常用抗體檢測方法的比對研究較少,需進一步積累數據。

          IFA

          該方法主要檢測Mp IgM抗體,特異度和敏感度較好,具有對照明顯、結果判讀和操作簡單等優點。但該實驗易受人為判斷熒光結果影響,包被抗原含量不足可能會產生假陰性,體內含有類風濕因子等與包被抗原有交叉反應可能出現假陽性。

          補體結合試驗(CFA)

          與其他檢測方法相比,CFA 采用糖脂抗原,特異性較差,操作過程中存在較多干擾,目前已經很少用于Mp臨床診斷。

          冷凝集試驗(CAT)

          冷凝集素增高也可見于其他疾病,如流行性感冒、傳染性單核細胞增多癥、風疹等,故CAT的特異性差,現已逐漸被其他Mp的檢測方法取代。


          檢驗前:樣本采集、運輸、保存規范


          新建 Microsoft Excel 工作表.png

          檢測中:方法學分級推薦

          鑒于 Mp 獨特的病原學特點、病原學檢測的合格取材問題、血清學檢測的時間窗和機體免疫條件影響以及不同檢測方法的敏感度、特異度的不同,采用一種檢測方法無法達到最終確診,因此病原學與血清學聯合診斷仍然是目前提倡的Mp感染診斷策略。


          推薦級別

          病原學方法

          血清學方法

          一級推薦

          RNA檢測

          顆粒凝集法抗體滴度測定

          二級推薦

          DNA檢測

          ELISA抗體分型檢測

          三級推薦

          培養法或直接檢測法

          間接免疫熒光法、免疫膠體金法;非特異性血清學檢測方法

          一級推薦,陽性可確診Mp感染,三級推薦方法中的Mp直接檢測法和GICT對門急診患者Mp感染診斷的快速初篩是有價值的,進一步診斷需一級、二級推薦方法的確認或動態復檢。


          檢驗后:結果解讀

          病原學檢測結果

          血清學檢測結果

          解釋

          +

          +

          基本可確診為Mp感染。此類患者,發病時間多超過一周,抗體已經產出,后期進行療程觀察時可采用RNA檢測。

          +

          -

          基本可確診為Mp早期感染。
            其一,發病時間較短,抗體尚未產生;
            其二,免疫系統發育不完善、免疫功能低下,未產生抗體或抗體滴度較低??贵w效價4倍變化可進一步確證Mp感染。

          -

          +

          需依據抗體陽性類型和滴度來判斷Mp的現癥或既往感染,多為治療后的既往感染。

          -

          -

          需依據抗體陽性類型和滴度來判斷Mp的現癥或既往感染,多為治療后的既往感染。


          共識一級推薦方法:SAT-RNA檢測技術


          SAT-RNA技術原理

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          ①      反應在42℃恒溫下進行,首先通過M-MLV反轉錄酶產生HBV RNA的一條帶有T7啟動子的雙鏈DNA。

          ②      然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA上擴增多個(100~1000個)RNA;

          ③      帶有熒光標記的探針和這些RNA特異結合,產生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲,并根據信號強度進行定量;

          ④      同時,每一個RNA再從反轉錄開始進入下一個擴增循環。 

          SAT技術特點

          - 專利樣本保存技術,維持RNA穩定:樣本保存液能在裂解病原體的同時有效保護RNA不被降解,可冷藏保存一周,保證檢驗前質量


          - 特異性靶標捕獲磁珠提取技術,特異性高:磁珠帶有特異性MP-RNA捕獲片段,最大限度去除反應抑制劑,提升擴增效率


          - 實時熒光擴增檢測,高效特異:采用分子信標探針,特異性高,擴增和檢測在一個反應管內實時完成,不用開蓋,操作簡單,無需產物分析區,有效控制產物污染


          - 配套自動化平臺,操作簡單,報告快速:已實現樣本進,結果出的全自動檢測,且能單個樣本隨時上機,1.5小時內完成檢測,滿足門急診TAT要求

          SAT技術獲得MP臨床共識推薦

          兒童肺炎支原體診治專家共識2015:

          SAT能反映MP在人體內的生存情況,為疾病分期提供參考。其不受年齡、產生抗體的能力、病程早晚及用藥等因素的影響,尤其在MP感染早期的檢出率最高。


          兒童肺炎支原體中西醫結合診治專家共識2017:

          SAT在核酸檢測技術中最敏感,可檢測特異性RNA,陽性結果能反映MP在患者體內的存活情況。

          END
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